1、適用范圍

本方法適用于清汁、濁汁、水和濃縮果汁中的耐酸耐熱菌的檢測。

2、儀器和試劑

2.1 恒溫水浴：80±1℃。

2.2 恒溫培養箱：40±1℃。

2.3 滅菌培養皿：直徑為90mm。

2.4 滅菌試管：18×180mm。

2.5 濾膜：0.45um水系一次性濾膜。

2.6 酵母粉。

2.7 蛋白胨。

2.8 瓊脂粉。

2.9 葡萄糖。

2.10 吐溫80。

2.11 12.5%蘋果酸。

2.12 滅菌蒸餾水。

2.13 K氏培養基平板：在1000ml的三角瓶中放入500ml蒸餾水，加入1.25g酵母粉、2.50g蛋白胨、6.50g瓊脂粉、0.5g 葡萄糖和0.5ml吐溫80，使其溶解，輕輕蓋上三角瓶的蓋子，在121℃滅菌25分鐘；在一個小燒杯中加入10ml蒸餾水和1.25克的蘋果酸，攪拌直至溶解，將蘋果酸的水溶液用0.45um的濾膜過濾，將處理過的蘋果酸水溶液加入到滅菌的K氏培養基中，攪拌均勻，使其pH值達到3.7±0.1。當冷卻到大約50℃時，將K氏培養基傾注到培養皿中，凝固后在0-5℃的冰箱中儲存，有效期60天，并記錄配制日期。

3、操作步驟

3.1 樣品處理

3.1.1 濃縮清汁：

打開水浴鍋，調整溫度到80±1℃。以無菌操作，取10ml濃縮清汁于15ml滅菌的試管中，再移取10ml濃縮清汁于另一帶有溫度計的15mL的試管中，作為溫度控制用，蓋上樣品試管的蓋子。將上述樣品試管和溫度控制試管放在水浴鍋中，當溫度達到80±1℃，開始計時，維持13分鐘（用計時器計時）。冷卻至室溫，用90-100ml的滅菌蒸餾水將熱處理過的樣品轉入滅菌容器中，搖勻。將稀釋后的樣品溶液用0.45um的濾膜真空過濾。

3.1.2 清汁、水：

打開水浴鍋，調整溫度到80±1℃。以無菌操作，取150ml清汁（或水）于已滅過菌的玻璃樣品瓶中，再移取150ml清汁（或水）于另一帶有溫度計的玻璃樣品瓶中，作為溫度控制用，蓋上樣品瓶的蓋子。將上述樣品試管和溫度控制試管放在水浴鍋中，當溫度達到80±1℃，開始計時，維持13分鐘（用計時器計時）。將熱處理過的樣品冷卻至室溫，用0.45um的濾膜真空過濾。

3.1.3 濁汁：

打開水浴鍋，調整溫度到80±1℃。以無菌操作,取20ml濁汁于已滅過菌的試管中,再移取20ml濁汁于另一帶有溫度計的20mL的試管中，作為溫度控制用，蓋上樣品試管的蓋子。將上述樣品試管和溫度控制試管放在水浴鍋中,當溫度達到80±1℃時,開始計時，維持13分鐘（用計時器計時）。冷卻至室溫，將熱處理的樣品用0.45um的濾膜真空過濾。

3.2 培養及計數

取掉過濾器的上部裝置，用滅菌的鑷子，將過濾膜從過濾器上取下放在K氏培養基上，輕敲數次，以保證濾膜與培養基接觸。倒置于40-41℃恒溫培養箱中，在恒溫培養箱底部放置一個有水的盤子，以調整恒溫培養箱的濕度，培養5天。培養結束后，記錄該培養溫度下濾膜上的菌落數。

根據對樣品的污染情況，可選擇稀釋度。用滅菌吸管吸取25ml樣品，加入到225ml滅菌蒸餾水中，做成1：10的稀釋度；用滅菌吸管吸取1：10的稀釋液25ml，加入到225ml滅菌蒸餾水中，做成1：100的稀釋度，稀釋后的樣品的檢測方法同上。培養結束后，記錄濾膜上的菌落數，并按相應的稀釋度進行計算。

4、數據處理

結果報告10ml的濃縮清汁樣品中含有的菌落數,報告單位為cfu/10ml。

結果報告150ml的清汁（或水）樣品中含有的菌落數，報告單位為cfu/150ml。

結果報告20ml的濁汁樣品中含有的菌落數，報告單位為cfu/20ml。